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恒远文献:CaCl2·2H2O,NaH2PO4·2H2O,NaHPO4·2H2O文献

点击次数:76    发布时间:2020/4/3 11:18:37

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资料简介:

磷离子对 BM-hMSCs 增殖及成骨分化的影响
雷 群 1 陈 江 1△ 林恒章 2 黄文秀 1 吴 东 1 杨 静 1
(1 福建医科大学附属口腔医院 福建 福州 350000;2 福建省级机关医院口腔科 福建 福州 350000)

摘要 目的:探讨磷离子对人骨髓来源的间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,BM-hMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法:从 ScienCell 实验室购买的 BM-hMSCs 分别在无血清生长培养基(对照组)和添加 4mmol(4P 组)、8mmol(8P 组)磷离子的无血清生长培养基中培养 21 天,通过 CCK8 比色法评估细胞的增殖情况;RT-PCR 检测成骨分化标记性基因胶原蛋白Ⅰ、骨钙素、碱性磷酸酶的表达水平;茜素红染色检测 BM-hMSCs 成骨分化产生的矿化结节。结果:在培养 4、7、14 天时,4P 和 8P 组中BM-hMSCs 的增殖都明显高于对照组,且 8P 组中 BM-hMSCs 的增殖高于 4P 组;培养 21 天时,4P 和 8P 组中 BM-hMSCs 的增殖明显低于对照组。与对照组相比,在培养 7 天时,4P 和 8P 组 OC 的表达下调,而 14、21 天时,OC 的表达上调。4P 和 8P 组中 ALP的表达水平与对照组无明显差异。7 天时,4P、8P 组 ColⅠ的表达水平均明显高与对照组;14 天时,8P 组 ColⅠ的表达水平与对照组表达无明显差异;21 天时,4P、8P 组中 ColⅠ的表达水平都均与对照组表达无明显差异。培养 21 天时,4P、8P 组矿化结节的形成明显增加。结论:磷离子在早期可以促进 BM-hMSCs 的增殖,晚期诱导其成骨分化。
关键词:磷离子;骨髓间充质干细胞;增殖;成骨分化
中图分类号:R78 文献标识码:A 文章编号:1673-6273(2014)35-6839-04
前言
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种在体外能进行反复自我复制、并保持其生物学性能特别是多向分化潜能的细胞。在不同因素的诱导刺激下,MSCs 可以向不同的细胞系分化生长。骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs) 因其独特的优势近年来也引起了研究者的广泛关注[1-3]。扩增人的间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs) 特别是人骨髓来源的间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,BM-hMSCs) 后通过基因疗法或者构建骨组织工程用于骨组织再生或骨组织缺损修复的方法成为了当前研究的热点。而我们所面临的一个重要挑战是确定促进 BM-hMSCs 增殖和成骨分化的因素和途径。
磷是人体骨骼无机成分的主要组成部分,而骨骼中含有全身 80%的磷[4]。人工合成的各种含磷骨粉及支架材料因具有良好的生物相容性和机械性能,已被广泛用于口腔及整形外科的骨缺损修复。以支架材料复合种子细胞构建的组织工程骨较传统的填充材料在修复程度、修复速度、新生骨形态等方面具有更多的优越性,是骨组织工程学的重要研究内容,也是近年来的研究热点。了解骨粉、支架材料组成成分对种子细胞生物学行为与功能的影响对于更好的构建组织工程骨至关重要。以往关于磷离子(Pi)对其它干细胞的作用研究表明,4 mmol、8 mmol的 Pi 对干细胞的调控作用相对明显[5-7],但多数采用含血清的培养基进行细胞培养研究。血清的成分复杂,可能对研究结果有一定的影响,而且不同的物种对同一种材料的反映也不尽相同[8]。因此,本研究选择在无血清培养基培养条件下,探讨 4mmol、8 mmol 的 Pi 对 BM-hMSCs 增殖及成骨分化的影响,以期为未来更合理的应用磷材料提供更多的参考依据。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
人骨髓间充质干细胞(美国 ScienCell),间充质干细胞生长培养基 - 无血清(美国 ScienCell),间充质干细胞完全培养基(美
国 ScienCell),二水氯化钙(CaCl2·2H2O)(上海恒远),二水磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)(上海恒远),二水磷酸氢钠(NaHPO4·2H2O)(上海恒远),CCK8 试剂盒 (北京泰泽瑞达),Trizol 试剂盒(美国 Gibco),引物 (上海博亚),反转录酶(美国 Invitrogen),SYBR GreenⅠ荧光染料 (美国 Biotium),茜素红 (上海恒远)
1.2 主要仪器
液 氮 罐 ( 上 海 赛 岐 ),-80 ℃ 低 温 冰 箱 ( 德 国 HeraeusHFU586),CO2 培养箱 (德国 Heraeus BB622002),超净工作台(北京半导体设备厂 JJT-1300),全自动酶标仪 (美国 BIO),CFX96 实时定量 PCR 仪 (美国 Bio-Rad), 倒置显微镜 (日本Olympus)。
1.3 方法
1.3.1 实验分组 对照组 (GM): BM-hMSCs+ 间充质干细胞生长培养基 - 无血清4P 组:BM-hMSCs+4mM Pi+ 间充质干细胞生长培养基 -无血清8P 组:BM-hMSCs+8mM Pi+ 间充质干细胞生长培养基 -无血清1.3.2 Pi 离子溶液的制备 普通培养液中的 Pi 主要来源于NaH2PO4,但添加不同浓度的 NaH2PO4 将会对培养液 pH 值构成显著影响,因此本试验参照文献方法[9],将 NaH2PO4·2H2O 和NaH2PO4·2H2O 按 1:4 的摩尔比溶解于 Hepes 缓冲液制成 Pi 浓度为 400 和 800 mmol 的母液,通过孔径为 200 目筛网过滤。用无血清间充质干细胞生长培养基稀释母液配制成 Pi 浓度为 4和 8 mmol 的培养液。
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