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技术栏:磷酸化蛋白WB实验注意事项

点击次数:9676   发布时间:2024/4/28 10:06:51

 蛋白磷酸化是一种非常重要的翻译后加工,做信号通路必然是要检测蛋白磷酸化的,Western blot是评估蛋白磷酸化状态的常用方法,其实和跑正常蛋白没什么出入,只不过孵育的是识别磷酸化的抗体。下面恒远生物带大家总结一下实验中的注意要点。

一、关于磷酸化蛋白样品
裂解液问题蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应,取样品的过程要迅速,样品要新鲜,样品处理要在冰上操作,操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时,PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话,提取蛋白时采用液氮研磨的方法,研磨器具要提预冷,保持低温的状态。

提取磷酸化蛋白的裂解液新鲜配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,否则即使条带压出来也会很浅,结果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制剂。再者,还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸,如果是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠,上样不要煮沸,煮沸可能会破坏其磷酸化位点。

二、关于WB时背景和条带的问题
磷酸化蛋白WB时背景也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则背景太深盖住想要的那条带,时间过短则可能没有条带或者条带太浅。做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的条带以外,往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的条带,反而没有你想要的条带,所以压片后,一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。

三、关于蛋白总的表达量问题
研究完某一蛋白的磷酸化情况后也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法,一是:相同的样品在不同的孔中上样两次(可在相同的胶上,也可在不同的胶上),其一压磷酸化蛋白,另一压该蛋白总的表达量(包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白),甚至还可跑另一个胶,压内标。但是一般不建议如此做,因为这样比较时误差还是较大的。因此,比较公认的,也是常用的方法,即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去,然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次,再压内标。

更多实验资讯可咨询我司业务员。上海恒远生物科技有限公司拥有自己的实验室,备有业的技术研发团队,对于各种生物试剂,细胞,血清,ELISA试剂盒的研发与销售,实验提供免费代测服务,并提供精湛的技术服务,如果您有实验上的问题欢迎来咨询,为您提供业的一对一技术指导。
 

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