蛋白磷酸化是一种非常重要的翻译后加工，做信号通路必然是要检测蛋白磷酸化的，Western blot是评估蛋白磷酸化状态的常用方法，其实和跑正常蛋白没什么出入，只不过孵育的是识别磷酸化的抗体。下面恒远生物带大家总结一下实验中的注意要点。
一、关于磷酸化蛋白样品
裂解液问题蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理要在冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具要提预冷，保持低温的状态。
提取磷酸化蛋白的裂解液新鲜配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制剂。再者，还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠，上样不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
二、关于WB时背景和条带的问题
磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。
三、关于蛋白总的表达量问题
研究完某一蛋白的磷酸化情况后也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，也是常用的方法，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。
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