小动物学习记忆行为检测技术

               －－－－避暗法                          

一、实验目的

1、学习小白鼠学习记忆行为检测方法

   2、学习小鼠避暗自动测试仪的使用方法。

   3. 了解影响学习记忆功能的一些因素。

二、实验原理

    啮齿类动物系夜行性动物，喜欢黑暗的地方，而回避光亮之地。它将设法逃向暗处，此时在暗处给予其电刺激，小鼠会被迫逃回明亮处，并获得记忆。根据此原理设计的实验为一次性被动回避反应实验。

被动回避反应（Passive Avoidance Response）为二十世纪60年代后期发展起来的、普遍用于检测小动物学习记忆能力的一种动物模型。反应特征：动物必须学会躲避可怕的事件，而抑制其天然本性。被动回避反应有：避暗法（又称步入法step-through test）、跳台法（又称步下法step-down test）等。

三、实验器材

小白鼠 常用手术器械、亚**钠、东莨菪碱（scopolamine，Scop.）、生理盐水、35 %酒精。

四、实验步骤 

1. 实验仪器

小鼠避暗自动测试仪由控制器和活动箱两部分组成，可同时对6只小鼠进行实验。明暗实验箱之间有一小门供动物进出，当动物进入暗室被电击时，它可自动记录小鼠次从明室进入暗室的潜伏期和受到电击的次数，还可通过按键灵活地选择刺激电压和设置实验时间。

2. 实验程序：

2.1适应：将动物头朝室壁放入明室，两室之间的门洞敞开，让动物在两室内自由活动2-3分钟，取出后放回饲养笼。

2.2训练：第二天, 将动物放入明室, 它很快钻入暗室, 连接两室的门洞关闭，同时启动电刺激器, 动物足部受电击。如果动物在次训练时超过100秒不进暗室, 淘汰之或用手把它轻轻赶进暗室。

记录指标：

（1）记录动物自明室进入暗室的潜伏期，可作为判断给药后动物行为是否有变的一个指标。若药物致使动物镇静，则潜伏期显著长于对照组。

（2）记录动物受到电击后的反应，如剧烈嘶叫并跳跃，评为A级反应；微弱尖叫，评为B级反应；不叫，评为C级反应。受到电击后动物一般均跳跃。C级反应常伴动物跳跃，动物虽不尖叫，但正常动物均能感受电击疼痛，显示好的记忆成绩。C级反应多见于雄性动物。A级反应多见于雌性动物。该记录可作为动物痛域是否变化的一个辅助观察指标。

2.3重测试：训练后24小时（第三天），再次将动物放入明室，进行重测试。

记录指标：

（1）记录动物进入暗室的潜伏期，为步入潜伏期（step through latency, STL）。潜伏期设为300秒。

（2）记录动物300秒内进入暗室的错误次数，包括次错误进入暗室的次数。

实验设计举例

按照信息论将记忆简单划分为：记忆的获得（也即学习过程、信息的获得过程）、记忆的巩固（信息的保持过程）、记忆的再现（信息的提取过程）时，我们可依此来筛选作用于记忆不同阶段的认知药物。

在训练前、后或重测前给损伤动物记忆的药物，可分别观察该药物对记忆不同阶段的影响，在此之前给动物待检测认知药物，即可依据实验结果判断该认知药物对抗损伤药物的效果。为简化筛选工作，常选用实验步骤较少的小动物学习记忆测试方法，现以步入法为例说明如下。原理如图示。

适应 ———— 训练（电击）——— （24小时后）——— 重测（不电击）

       影响           影响                    影响

        记忆获得       记忆巩固                记忆再现

一、记忆获得过程

1. 建立记忆获得障碍模型：

在动物进行电击训练之前15-20分钟，给动物腹腔注射氢溴酸东莨菪碱（胆碱能M受体拮抗剂，HBr-Scopalamine），小鼠：3mg/kg，可见给药组动物出现探究行为，训练时在明室内驻留时间略长于对照组，进入暗室后受到电刺激时的反应与对照组相似：嘶叫或跳跃。24小时后当再次将动物放入明室时，动物进入暗室的潜伏期显著低于对照组，即制备成功记忆障碍模型。

2. 待测药物的服用：

根据待检测药物在动物体内的作用高峰时间，于相应时间给动物服药，如口服药物，可于训练前1小时给动物灌服待检测药物，然后再于训练前15-20分钟给动物损伤记忆获得的药物，如氢溴酸东莨菪碱等。

二、记忆巩固过程

1. 建立记忆巩固障碍模型：

动物电击训练结束后立即给动物腹腔注射蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（Cycloheximide，小鼠：90-100mg/kg）抑制蛋白质合成，或皮下注射NaNO2（小鼠：120mg/kg）导致动物短暂性缺氧，或给动物施行头部瞬间电休克。然后放回饲养盒内，24小时后重测试。

2. 待测药物的服用：

若是口服药物，于电击训练前药物作用高峰期（一般选1小时前）给动物灌服药物。若是腹腔注射药物，一般于训练前半小时注射。然后给动物电击训练，训练后立即给损伤记忆巩固药物或其它实验因素，24小时后重测试，可检测认知药物对记忆巩固障碍的对抗作用。

三、记忆再现过程

1. 建立记忆再现障碍模型

于动物重测试之前15分钟给小鼠灌服酒精（35%，0.1ml/10g鼠重），15分钟后进行重测试。可见小鼠记忆提取过程受到损伤。

2. 待测药物的服用：于动物重测试之前1小时给动物口服待检药物。

注意：

该损伤只有在重测前10-30分钟灌胃酒精才起作用, 时间长于30分钟则无效。

该剂量酒精只对较不巩固、一次性记忆有损伤作用，而对小鼠需经多次训练而获得的较巩固的记忆的再现无影响。

附： 步下法（step-down test），又称跳台法 

实验原理：

依据动物的习性，啮齿类动物在空旷的场地内，大多时间会逗留于墙边或角落。而被放在高台上时，便会依本能迅速跳下，躲避在墙边或墙角。跳台仪的底部可以通电，上面放置一个绝缘的跳台。动物在训练时受到电击，跳上跳台以躲避电击，从而获得记忆。动物的记忆力下降时，表现为次从跳台跳下的潜伏期缩短，跳下的次数增加。动物的记忆力增强时则跳下的潜伏期延长，触电次数明显减少。 

实验程序

1. 适应：将动物放上平台，使动物在箱内自由上下适应2-3分钟，然后将动物放回饲养盒。或每次适应10秒，共适应3次，间隔30分钟。后者使动物较前者更能充分适应实验者的手势和整个实验过程。

2. 训练：可在适应之后立即进行，也可在适应后24小时进行。

将动物再次放上平台, 同时开启电刺激器, 箱底铜栅供电。动物由于在箱内适应过，几乎马上跳下平台，四肢于是立即遭到电击。由于电击的疼痛，动物上下跳跃，偶尔于无意之中跳回平台，旋即又跳下平台，如此反复多次。

记录指标：

1）动物从放上平台至跳下平台的潜伏期；

2）动物反复下台的错误次数, 可代表动物的学习成绩；

3. 重测试：

训练后24小时重测试, 再次将动物放上平台，观察动物下台情况。

记录指标：

动物自放上平台后至跳下平台的潜伏期、5 分钟内跳下平台的错误次数, 此为动物的记忆成绩。