1.用靶蛋白（稀释于 50 mM 碳酸盐缓冲液 PH 9.0）包被反应板。*佳的浓度应该做滴度来获得。但对于纯化的抗原在1μg／ml浓度，每孔 50 μl一般情况下足够。用薄膜覆盖4oC孵育过夜。
2.移去抗原溶液。加入封闭液200μl／孔（PBS containing 1% BSA ａnd 0.02% azide）以封闭非特异蛋白的结合。室温下卵育1–2小时，或4oC过夜。
3.移去封闭液。用含有0.02%叠氮化钠的PBS漂洗一次。湿润的反应板（孔）在密封塑料袋中4oC下可保存4周。使用前移去多余液体。
4.加入用封闭液稀释的检测抗体和对照 50 μl／每孔。抗体可以做一个系列稀释以确定一个滴度或者用以前曾经用于筛选试验的浓度，以及根据抗原含量滴度。室温下孵育一小时。 5.用含0.05%Tween-20（Tween-20: sc-29113）PBS冲洗培养板3次。吸去多余的液体。
6.每孔加入50μl用封闭缓冲液稀释 1:100-1:1000 倍的碱性磷酸酶标记的二抗 （ WB 用常规二抗）。*佳的抗体浓度应通过滴度来获得。室温下孵育1小时。
7.移去孔内液体。用含0.005%Twenn-20PBS冲洗3次并风干。
8.用二乙醇胺缓冲液 （10 mM diethanolamine, 0.5 mM MgCl2 （pH 9.5） 冲洗培养孔并移去液体。
9.用二乙醇胺缓冲液（diethanolamine buffer）稀释底物（PNPP, sc-3720），*终浓度为1mg/ml。每孔加入50μl。反应10–20分钟或阳性对照的405／490 吸光度约为1.0。加入50μl0.1MEDTA（EDTA: sc-29092），PH 7.5。酶标仪读取405／490 nm 光吸收值。
原创作者：上海恒远生物科技有限公司
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