一、怎么选择合适的对照？

   1）同型对照：使用同型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合。

   2）阴性细胞对照：使用已知的不表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是消除抗体的非特异性结合。

   3）二抗对照：第二抗体多为荧光标记的多抗，非特异性结合一般较高，可能造成基础荧光值偏高，设立二抗对照平行实验的主要目的是消除二抗的非特异性荧光着色。

   4）阳性对照：一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。

   5）空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。

   二、收集的细胞通过流式仪检测时，一般多少的细胞量合适？

   进行流式检测时，至少需要记录5000个活细胞，一般调整细胞密度至1*106/100ul进行流式检测。

   三、FCM检测过程中如何设门（gating）？

   一般根据散射光进行设门，即我们通常所说的散（forward scatter, FSC）和侧散（side scatter, SSC）来设门。FSC的大小与细胞的直径成正相关，不同的细胞，细胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小与细胞内颗粒结构的质量成正相关，不同的细胞，细胞内颗粒结构越复杂，质量越大，其SSC越大；反之越小。

   四、FCM检测过程中如何调节补偿？

   在FCM检测过程中，如果存在多色，则必须进行荧光补偿调节。调节补偿先要知道双阴性细胞的情况，其次，必须要用单阳和双阴性细胞。只有在有阴性细胞作为参照的情况下，才能既不会过多又不会过少地调节补偿。

   五、FCM检测时，每次实验的细胞数一定要相同吗？

   FCM检测时，若不进行细胞计数而凭感觉随意进行实验会直接影响实验结果。当细胞量多而抗体量不变或细胞量不变而抗体量减少，那么荧光抗体平均分布到每个阳性细胞上的量就会相对减少。由此可见，不同的细胞量会影响终的实验结果。因此，在准备样本时，必须进行细胞计数，使每个分组及每次实验的细胞数保持一致。

   六、FCM检测时，如果存在多色分析，应该如何进行配色呢？

   在FCM检测过程中，如果存在多色分析，虽然可以通过荧光补偿来消除荧光光谱重叠的影响。但调节补偿过大在一定程度上仍然会影响测值的准确性，因此，我们一般建议尽量选择荧光光谱重叠少的荧光抗体组合。

原创作者：上海恒远生物科技有限公司